USŁUGA WYKONANIA BADAŃ I EKSPERYMENTÓW W CELU OKREŚLENIA WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNYCH SUBSTANCJI WYKAZUJĄCYCH DZIAŁANIE ANTYKOAGULACYJNE I PRZECIWPŁYTKOWE, WYIZOLOWANYCH Z ROŚLIN LECZNICZYCH - PAKIETY.

Opis przedmiotu przetargu: 1.Przedmiotem zamówienia jest wykonanie różnego rodzaju badań i eksperymentów, których celem jest określenie właściwości biologicznych polifenolowo-polisacharydowych substancji wykazujących działanie antykoagulacyjne i przeciwpłytkowe, wyizolowanych z wybranych roślin leczniczych. Usługa realizowana będzie na potrzeby prac prowadzonych przez zespół naukowców Zamawiającego zaangażowanych w Zadanie badawcze pn. Antykoagulanty pochodzenia roślinnego z perspektywą wykorzystania w profilaktyce i leczeniu zakrzepic. Przeciwagregacyjne właściwości preparatów roślinnych. 2.Szczegółowy zakres zamówienia został ujęty w następujących czterech Pakietach (A-D): 1)PAKIET A-Usługa badań w celu określenia właściwości antyoksydacyjnych preparatów roślinnych względem płytek krwi, metodami kolorymetrycznymi i biologicznymi. Pakiet A dotyczy wykonania badań w celu określenia właściwości antyoksydacyjnych względem płytek krwi ludzkiej. Materiał badawczy stanowić będą na bieżąco przekazywane przez Zamawiającego Wykonawcy różne preparaty roślinne (ok. 10, oraz do 5 ich frakcji), zawierające substancje o charakterze polisacharydów, polifenoli oraz glikokoniugatów polifenolowo-polisacharydowych. Udostępnienie pierwszej partii materiałów, umożliwiającej rozpoczęcie analiz, Zamawiający przekaże w ciągu 5 dni od zawarcia umowy z Wykonawcą. Zakres usługi w Pakiecie A obejmuje: a)Badania mające na celu określenie potencjału antyoksydacyjnego preparatów roślinnych i/lub ich frakcji poprzez oznaczenie ich statusu TAS (total antoxidant status) metodą kolorymetryczną, w serii roztworów badanych preparatów roślinnych, nie mniejszej niż 4 różne wybrane stężenia, przy uwzględnieniu grupy kontrolnej oraz badania wobec kontroli pozytywnej, przy co najmniej 3-krotnej powtarzalności rezultatów, b)Badanie mające na celu określenie wpływu preparatów roślinnych i/lub ich frakcji na zmiany zachodzące w cząsteczkach białek, indukowane działaniem nadtlenoazotynu, we krwi pobranej od co najmniej 10 pacjentów z chorobą sercowo-naczyniową. Przebadane powinny zostać te preparaty roślinne i/lub ich frakcje, które wykażą najsilniejsze właściwości ochronne uzyskane w testach przesiewowych, wykonanych na materiale pochodzącym od co najmniej 5 zdrowych ochotników, w wieku 18-30 lat, nie stosujących na co najmniej 12 dni przed oddaniem krwi leków przeciwzapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi. W tym celu należy wykonać: -badania w celu oceny stopnia utlenienia białek płytkowych przez nadtlenoazotyn poprzez oznaczenie poziomu grup karbonylowych z wykorzystaniem testu ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assai) -badania w celu oceny stopnia nitrowania białek płytkowych przez nadtlenoazotyn poprzez oznaczenie poziomu 3-nitrotyrozyny z wykorzystaniem kompetycyjnego testu ELISA, -badania w celu oceny stopnia utlenienia białek osocza przez nadtlenoazotyn, poprzez oznaczenie poziomu grup karbonylowych z wykorzystaniem testu ELISA, -badania w celu oceny stopnia nitrowania białek osocza przez nadtlenoazotyn poprzez oznaczenie poziomu 3-nitrotyrozyny z wykorzystaniem kompetycyjnego testu ELISA; c)Badania nad określeniem wpływu preparatów roślinnych i/lub ich frakcji na aktywność trombiny oraz trombinową aktywację płytek krwi. W tym należy wykonać: -badanie wpływu preparatów roślinnych i/lub ich frakcji na aktywność trombiny oznaczaną metodą z substratem chromogennym, dla każdego z badanych preparatów roślinnych i/lub ich frakcji, porównując otrzymane rezultaty z badaniem kontrolnym oraz z rezultatem dla kontroli pozytywnej, przy zachowaniu co najmniej 3-krotnej powtarzalności rezultatów, -oznaczenie poziomu trwałego metabolitu tromboksanu (TXB2) w płytkach krwi aktywowanych trombiną, przy zastosowaniu metody immunoenzymatycznej, dla co najmniej 5 zdrowych ochotników w wieku 18-30 lat, nie stosujących na co najmniej 12 dni przed oddaniem krwi leków przeciwzapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi, stanowiących prawidłową kontrolę, a dla co najmniej 10 pacjentów z chorobą sercowo naczyniową - przebadane powinny zostać te preparaty roślinne i/lub ich frakcje, które w testach przesiewowych wykonanych na materiale pochodzącym od zdrowych ochotników wykażą najsilniejsze właściwości ochronne, -wykonanie pomiarów ogólnego potencjału tworzenia skrzepu i fibrynolizy (OCFF) w osoczu pod wpływem trombiny, poddawanej działaniu badanych preparatów roślinnych i/lub ich frakcji, dla co najmniej 5 zdrowych ochotników w wieku 18-30 lat, nie stosujących na co najmniej 12 dni przed oddaniem krwi leków przeciwzapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi, stanowiących prawidłową kontrolę, a dla co najmniej 10 pacjentów z chorobą sercowo naczyniową-przebadane powinny zostać te preparaty i/lub ich frakcje, które w testach przesiewowych wykonanych na materiale pochodzącym od zdrowych ochotników wykażą najsilniejsze właściwości ochronne. 2)PAKIET B-Usługa badań potencjalnej cytotoksyczności oraz kancerogenności in vitro preparatów roślinnych metodami biologicznymi i/lub kolorymetrycznymi, wraz z badaniami ich właściwości immunomodulacyjnych in vitro metodą immunoenzymatyczną. Pakiet B dotyczy wykonania badań w celu określenia potencjalnej cytotoksyczności oraz kancerogenności in vitro metodami biologicznymi i/lub kolorymetrycznymi, oraz badań zmierzających do określenia właściwości immunomodulacyjnych in vitro metodą immunoenzymatyczną (ELISA). Materiał badawczy stanowić będą na bieżąco przekazywane przez Zamawiającego Wykonawcy różne preparaty roślinne (ok. 10, oraz do 5 ich frakcji), zawierające substancje o charakterze polisacharydów, polifenoli oraz glikokoniugatów polifenolowo-polisacharydowych. Udostępnienie pierwszej partii materiałów, umożliwiającej rozpoczęcie analiz, Zamawiający przekaże w ciągu 5 dni od zawarcia umowy z Wykonawcą. Zakres usługi w Pakiecie B obejmuje: a)badania na standardowych liniach komórkowych wg. normy PN-EN ISO 10993-5, 2009 lub w sposób równoważny-uwzględniając co najmniej 3-krotne powtórzenie eksperymentów; b)badania na komórkach endotelium, zakupionych przez Wykonawcę w banku tkanek, oraz na komórkach krwi ludzkiej od zdrowych dawców, ochotników w wieku 18-30 lat, nie stosujących na co najmniej 12 dni przed oddaniem krwi leków przeciwzapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi-badania należy wykonać przy uwzględnieniu co najmniej 10-krotnego powtórzenia eksperymentów, uwzględniając grupę kontrolną w ilości co najmniej 5-krotnego powtórzenia eksperymentów, oraz grupę kontroli pozytywnej w ilości co najmniej 5-krotnego powtórzenia eksperymentów, w celu oznaczenia reakcji immunologicznej, którą mogą wywoływać preparaty roślinne i/lub ich frakcje, c)badania mające na celu określenie, czy preparaty roślinne i/lub ich frakcje wykazują potencjalną mutagenność-wykonane in vitro przy wykorzystaniu testów Amesa na genotoksyczność, wg. norm PN-EN ISO 10993-3 : 2009 i/lub PN-EN ISO 10993-12 : 2009 lub w sposób równoważny, z powtarzalnością określoną przez ww. normy, d)badania polegające na oznaczeniu poziomu co najmniej dwóch wybranych cytokin prozapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi, produkowanych przez komórki krwi obwodowej ludzkiej zdrowych dawców, w wieku 18-30 lat, nie stosujących na co najmniej 12 dni przed oddaniem krwi leków przeciwzapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi - badania powinny być wykonane w serii co najmniej 3 stężeń każdego z preparatów roślinnych i/lub ich frakcji, w zakresie nie mniejszym niż 10-200 µg/mL w badanym układzie eksperymentalnym, przy uwzględnieniu co najmniej 10-krotnego powtórzenia eksperymentów; badania powinny uwzględniać grupę kontrolną w ilości co najmniej 10-krotnego powtórzenia eksperymentów, oraz grupę kontroli pozytywnej w ilości co najmniej 10-krotnego powtórzenia eksperymentów, e)badania mające na celu ocenę stopnia aktywacji transkrypcyjnego czynnika jądrowego (NF-kappa B), odpowiedzialnego za produkcję immunocytochemiczną prozapalnych cytokin, przez preparaty roślinne i/lub ich frakcje; badania należy wykonać przy uwzględnieniu co najmniej 5-krotnego powtórzenia eksperymentów, uwzględniając grupę kontrolną w ilości co najmniej 5-krotnego powtórzenia eksperymentów, oraz grupę kontroli pozytywnej w ilości co najmniej 5-krotnego powtórzenia eksperymentów, w celu oznaczenia efektu stanowiącego przedmiot badania. 3)PAKIET C-Usługa badań wobec płytek krwi ludzkiej, w celu oceny potencjalnych właściwości przeciwpłytkowych i/lub antyagregacyjnych preparatów roślinnych oraz ich frakcji. Pakiet C dotyczy wykonania badań wobec płytek krwi ludzkiej, w celu oceny potencjalnych właściwości przeciwpłytkowych i/lub antyagregacyjnych. Materiał badawczy stanowić będą na bieżąco przekazywane przez Zamawiającego Wykonawcy różne preparaty roślinne (ok. 10, oraz do 5 ich frakcji), zawierające substancje o charakterze polisacharydów, polifenoli oraz glikokoniugatów polifenolowo-polisacharydowych. Udostępnienie pierwszej partii materiałów, umożliwiającej rozpoczęcie analiz, Zamawiający przekaże w ciągu 5 dni od zawarcia umowy z Wykonawcą. Zakres usługi w Pakiecie C obejmuje: a)wykonanie badań polegających na określeniu stopnia hamowania w warunkach in vitro reaktywności płytek krwi ludzkiej, pobranej od dawców-co najmniej 10 pacjentów z chorobą sercowo-naczyniową, w zależności od stężenia leków przeciwpłytkowych: kwas acetylosalicylowy i prasugrel i/lub klopidogrel; wymagane jest ustalenie wartości EC50 hamowania reaktywności płytek krwi przez ww. leki oraz dokonanie oceny wpływu wybranych co najmniej 5 różnych stężeń każdego z preparatów roślinnych i/lub ich frakcji, w zakresie co najmniej 50-200 µg/mL w badanym układzie eksperymentalnym, w celu określenia dopełniającego efektu hamowania funkcji płytek krwi ludzkiej przez ww. preparaty roślinne; b)ocenę wpływu in vitro każdego z preparatów roślinnych i/lub ich frakcji na procesy agregacji płytek w osoczu bogatopłytkowym co najmniej 10 pacjentów z przewlekłą chorobą sercowo-naczyniową, metodą agregometryczną, dla co najmniej 5 różnych stężeń każdego z preparatów roślinnych i/lub ich frakcji, w zakresie co najmniej 50-200 µg/mL w badanym układzie eksperymentalnym; c)ocenę wpływu każdego z preparatów roślinnych i/lub ich frakcji na ekspresję receptorów błonowych i szlaków pobudzenia płytek krwi metodą cytofluorymetrii przepływowej; wymagane jest porównanie uzyskanych wyników z działaniem dopuszczonych do lecznictwa substancji przeciwpłytkowych, takich jak kwas acetylosalicylowy, pochodna dożylna klopidogrelu, blokery białka IIb/IIIa; badania należy wykonać na materiale pochodzącym od co najmniej 10 zdrowych ochotników, w wieku 18-30 lat, nie stosujących na co najmniej 12 dni przed oddaniem krwi leków przeciwzapalnych, w szczególności zaburzających krzepnięcie krwi. 4)PAKIET D-Usługa badań oceny sprawności mechanizmów osoczowego układu krzepnięcia we krwi szczurów dla preparatów roślinnych oraz ich frakcji, wraz z oceną cytotoksyczności wobec tkanek szczurów. Pakiet D dotyczy wykonania badań mających na celu określenie sprawności mechanizmów osoczowego układu krzepnięcia we krwi zwierząt doświadczalnych (szczury rasy Wistar, samce z chowu wsobnego o masie ciała w przedziale 270 - 360 g). Doświadczenia dotyczyć będą również oceny cytotoksyczności ww. preparatów roślinnych oraz ich frakcji wobec tkanek badanych zwierząt doświadczalnych, na których przeprowadzano ww. doświadczenia. Materiał badawczy stanowić będą na bieżąco przekazywane Wykonawcy przez Zamawiającego różne preparaty roślinne (ok. 10, oraz do 5 ich frakcji), zawierające substancje o charakterze polisacharydów, polifenoli oraz glikokoniugatów polifenolowo-polisacharydowych. Udostępnienie pierwszej partii materiałów, umożliwiającej rozpoczęcie analiz, Zamawiający przekaże w ciągu 5 dni od zawarcia umowy z Wykonawcą. Zakres usługi w Pakiecie D obejmuje: a)wykonanie badań na krwi zwierząt, nie mniejszej niż 5 sztuk, w przypadku grupy kontrolnej oraz nie mniejszej niż 5 sztuk w przypadku grup eksperymentalnych, dla każdego z nie więcej niż 3 preparatów roślinnych oraz nie więcej niż 5 ich frakcji, który powinien być podany domięśniowo doświadczalnej grupie zwierząt, a następnie próbki krwi powinny być pobierane zarówno od szczurów stanowiących grupę kontrolną, jak i od szczurów stanowiących grupy doświadczalne, w sekwencji czasowej trwającej 5 godzin, uwzględniając dla każdego badanego preparatu co najmniej 3 różne odstępy czasowe, wykonując eksperymenty z uwzględnieniem co najmniej 3-krotnej powtarzalności eksperymentów, b)wykonanie pomiarów: czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT), czasu protrombinowego (PT), czasu trombinowego (TT) oraz pomiarów stężenia fibrynogenu, z co najmniej 3-krotną powtarzalnością eksperymentów, dla zebranych próbek krwi, zarówno od grup doświadczalnych jak i grupy kontrolnej, a także wykonanie dla wszystkich próbek krwi zebranych w grupie kontrolnej oraz dla wybranych próbek krwi zebranych w grupach doświadczalnych, w przypadku kiedy którykolwiek preparat roślinny i/lub frakcja wykaże znaczącą aktywność w ww. testach, następujących badań: -badania dotyczące aktywności osoczowych czynników krzepnięcia, takich jak czynniki II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, -badania dotyczące aktywności antytrombiny oraz pomiary aktywności białka C, z zastosowaniem substratów chromogennych, -pomiary stężeń D-dimerów, metodą immunochemiczną z użyciem swoistych przeciwciał; c)wykonanie badań wpływu nie więcej niż 10 preparatów roślinnych oraz nie więcej niż 5 ich frakcji na reaktywność leukocytów krwi obwodowej pobranej od zwierząt stanowiących grupę kontrolną oraz pobranej od zwierząt, stanowiących wybrane grupy eksperymentalne, gdzie po podaniu preparatów roślinnych i/lub frakcji, wykażą one znaczącą aktywność w testach aPTT, PT oraz TT; każde z tych badań powinno zostać wykonane z co najmniej 3-krotną powtarzalnością eksperymentów, a należą do nich: -badania pełnej morfologii krwi, w tym: RBC, Hb, Ht, RDW, MCV, MCH, MCHC, WBC, z uwzględnieniem udziału procentowego i wartości bezwzględnych poszczególnych frakcji leukocytów, PLT, MPV, PDW, PCT, P-LCR, -identyfikacja subpopulacji limfocytów przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, -badania zdolności fagocytarnej leukocytów z użyciem komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae; określenie żywotności i fazy cyklu komórkowego leukocytów, -badania zdolności granulocytów do produkcji aktywnych związków tlenu na podstawie zdolności redukcji błękitu nitrotetrazoliowego (NBT), -badania zdolności komórek jednojądrzastych krwi do tworzenia radialnej segmentacji jąder; d)wykonanie badań mających na celu ocenę cytotoksyczności nie więcej niż 10 preparatów roślinnych oraz nie więcej niż 5 ich frakcji, wobec tkanek pobranych od zwierząt doświadczalnych, stanowiących grupy eksperymentalne, w porównaniu z tkankami zwierząt stanowiącymi grupę kontrolną; zakres badań przewiduje wykonanie oceny różnych narządów wewnętrznych, w tym co najmniej z płuc, mięśnia sercowego, wątroby oraz z nerek; tok prac powinien uwzględniać następujące czynności: -pobranie narządów w trakcie sekcji zwłok zwierząt doświadczalnych, -minimum 24-godzinne utrwalenie w 4% zbuforowanym, roztworze formaliny, -wycięcie skrawków do preparatyki histopatologicznej, -odwodnienie preparatów w acetonie, ksylenie i szeregu alkoholowym, -zatopienie skrawków w parafinowe bloczki i wykonanie skrawków mikrotomowych o grubości 4 µm, -odparafinowanie i barwienie preparatów rutynową metodą hematoksylina i eozyna (HE), -w celu weryfikacji obserwacji dwukrotne oglądanie preparatów w mikroskopie świetlnym i archiwizacja istotnych zmian przy pomocy kamery zintegrowanej z mikroskopem i komputerem. Ponadto Zamawiający na własny koszt zapewniać będzie na bieżąco Wykonawcy zwierzęta doświadczalne (szczury) w ilości i o parametrach określonych w niniejszym zamówieniu. Pierwsza dostawa szczurów nastąpi w ciągu 14 dni od zawarcia umowy z Wykonawcą. 3.Wykonawca dostarczy (odrębnie dla każdego Pakietu, na który będzie zawarta z nim umowa) dokumentację dotyczącą prowadzonych badań, w formie wydruków oraz wersji elektronicznej, w formacie do odczytu i edycji z wykorzystaniem oprogramowania MS Office: a)Raport częściowy (co trzy miesiące), z każdej wykonanej serii badań, który uwzględni zagadnienia będące zapisem każdego z wykonanych eksperymentów, w postaci opisu metodyki jego/ich przygotowania i wykonania, wyników w formie danych liczbowych i/lub wykresów i/lub zarejestrowanych obrazów wraz z ich interpretacją. b)Raport końcowy, zawierający szczegółowy opis uzyskanych wyników, zarejestrowane obrazy, wykresy i tabele oraz wnioski z przeprowadzonych prac badawczych. c)Raporty przekazywane będą Zamawiającemu w terminie 5 dni odpowiednio: po zakończeniu każdych trzech miesięcy, po zakończeniu realizacji usługi. Zamawiający zastrzega sobie prawo do zgłaszania uwag do raportów częściowych i raportu końcowego (w terminie do 20 dni od daty przekazania poszczególnych raportów), do których Wykonawca ma obowiązek niezwłocznie ustosunkować się. 4.Wykonawca jest zobowiązany do przygotowania końcowej prezentacji (w programie Ms Power Point lub Flash) przedstawiającej uzyskane wyniki i wnioski oraz przedstawienie jej na seminarium zorganizowanym w siedzibie Zamawiającego w terminie do 15 dni od daty przekazania Raportu końcowego. 5.Dotyczy pakietu nr A, B, C i D W terminie do 3 miesięcy od dnia zawarcia umowy na realizację usługi, Wykonawca jest zobowiązany dostarczyć Zamawiającemu kopię (a na jego żądanie umożliwić też wgląd do oryginału) pozwolenia na prowadzenie badań z zakresie przedmiotowej umowy, wydanego przez właściwą Lokalną Komisję Etyczną (LKE). W przypadku braku uzyskania tego rodzaju pozwolenia, Zamawiający ma prawo rozwiązać umowę z Wykonawcą ze skutkiem natychmiastowym, z przyczyn leżących po stornie Wykonawcy, a Wykonawcy nie będą z tego tytułu przysługiwać żadne roszczenia finansowe względem Zamawiającego. Ponadto do czasu okazania przez Wykonawcę pozwolenia LKE, Zamawiający nie dokona żadnych płatności na rzecz Wykonawcy. Koszt eksploatacji własnej aparatury laboratoryjnej, udostępnienia aparatury badawczej od podmiotów trzecich, a także przewozu od Zamawiającego próbek materiałów poddawanych analizom pokrywany jest przez Wykonawcę w ramach powierzonej mu usługi. Zamawiający dostarcza drobne materiały laboratoryjne i odczynniki niezbędne do realizacji usługi. 6.Dotyczy pakietu nr A i D Dodatkowo, w ciągu 3 miesięcy od dnia zawarcia umowy Zamawiający udostępni Wykonawcy na czas realizacji usługi czytnik ELISA-zestaw wyposażony w detektor typu UV-Vis, wyposażony w moduł podgrzewania i wytrząsania, oprogramowanie do obróbki danych.