Wybór grupy badawczej WGRB 02 10

Opis przedmiotu przetargu: Wybór grupy badawczej, która podejmie się wykonać badania naukowe opisane w ramach dwu zadań - Zadania 7, podzadania 7.2 i 7.3 oraz Zadania 8, podzadania 8.2, 8.3, 8.4, wynikających z realizacji umowy zawartej w dniu 15 września 2009 roku pomiędzy IBB PAN a Ośrodkiem Przetwarzania Informacji o dofinansowanie projektu numer UDA-POIG.01.03.01-14-036/09-00 pod tytułem Zastosowanie pochodnych poliizoprenoidów jako nośników leków i regulatorów metabolizmu realizowanego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, lata 2007-2013, Priorytet 1. Badania i Rozwój Nowoczesnych Technologii, Działanie 1.3 Wsparcie Projektów B+R na rzecz przedsiębiorców realizowanych przez jednostki naukowe, Poddziałanie 1.3.1 Projekty rozwojowe. Badania będą polegały na: Zadanie 7. Badanie właściwości epoksy-Prenoli podwyższających poziom biosyntezy ubichinonu i obniżających biosyntezę cholesterolu 7.2. Badanie wpływu epoksy-Prenoli i ich pochodnych na metabolizm ubichinonu i cholesterolu w komórkach ssaków; Epoksydowane pochodne poliizoprenoidów i ich hydrolizowane pochodne, a także znakowany trytem mewalonian przygotowane będą we współpracy z IBB PAN. Preparaty epoksydowanych poliizoprenoidów i ich hydrolizowanych pochodnych będą dodawane do mediów hodowlanych linii komórkowych równocześnie z trytowanym mewalonianem. Analogicznie, substraty te podawane zwierzętom hodowlanym (myszy lub szczury). Warunki doświadczenia będą optymalizowane. Z zebranego materiału biologicznego (komórki z hodowli, organy zwierząt - głównie wątroba, nerki, serce) wyizolowane i oznaczone ilościowo zostaną interesujące nas lipidy, cholesterol, ubichinon, dolichol, estry cholesterylu, , estry dolichylu, oraz pochodzące z diety tokoferole (HPLC/UV). Powstawanie znakowanych izotopowo lipidów (t.j. cholosterolu, ubichinonu i dolicholu) także będzie mierzone (HPLC/UV/przepływowy detektor radioaktywności). Przeprowadzone będą badania zawartości i poziomu znakowania lipidów w organellach komórkowych (np. mitochondria, retikulum endoplazmatyczne) wybranych organów(wątroba, nerki). Dla ubichinonu i ew. tokoferolu analiza uzupełniona będzie o ocenę ilości zredukowanego ubichinonu i tokoferolu - ten pomiar wykonany będzie techniką HPLC z zastosowaniem detektora elektrochemicznego (HPLC/ED). 7.3. Badanie wpływu epoksydów na okres półtrwania ubichinonu Dla wybranych epoksydów badany będzie także ich efekt na okres półtrwania UQ. Radioaktywnego prekursora ([3H]mewalonianu) podawany będzie zwierzętom przez określony okres, a następnie mierzony będzie zanik radioaktywności [3H]UQ. Takie badania wymagają wykorzystania dużej liczby zwierząt (po 3-4 na każdy punkt czasowy, przewiduje się ok. 10 punktów czasowych). Metodyka badań wymaga zastosowania aparatu HPLC/UV sprzężonego z przepływowym detektorem radioaktywności do pomiaru radioaktywności radioaktywnego UQ. Efekty merytoryczne Zadania 7 uzyskane w przez grupę badawczą: 2 lata realizacji projektu ocena wpływu wybranych epoksy-Prenoli i ich pochodnych na metabolizm ubichinonu i cholesterolu w modelowych liniach komórkowych (HepG2) 2,5 roku realizacji projektu ocena wpływu wybranych epoksy-Prenoli na metabolizm ubichinonu i cholesterolu in vivo (myszy) 3 lata realizacji projektu zbadanie wpływu epoksydów na okres półtrwania ubichinonu 4 lata realizacji projektu przygotowanie zgłoszeń patentowych Zadanie 8. Badania metabolizmu i toksyczności amino-Prenoli oraz epoksy-Prenoli. 8.2. Podawanie amino-[3H]Prenoli lub epoksy-[3H]Prenoli do hodowli komórkowych i zwierzętom hodowlanym Znakowane trytem amino-[3H]Prenole przygotowane będą we współpracy z IBB PAN i IChO PAN. Znakowane trytem epoksy-[3H]Prenole przygotowane będą we współpracy z IBB PAN. Zsyntetyzowane amino-[3H]Prenole lub epoksy-[3H]Pren podawane będą do medium hodowlanego, w którym hodowane będą komórki ssacze. Pochodne [3H]Prenoli będą podawane w roztworze etanolowym lub roztworze dwumetylosulfotlenku (DMSO). Na początkowym etapie badań wykorzystana zostanie linia HepG2. Hodowle prowadzone będą dla różnych stężeń trytowanego prekursora i w różnych czasach inkubacji, aby zaobserwować możliwe szerokie spektrum produktów. Równolegle, amino-[3H]Prenole lub epoksy-[3H]Prenole podawane będą myszom. Testowane będą różne drogi podawania (np. injekcje dootrzewnowe). Zwierzęta będą uśmiercone po 6, 12 i 24h od czasu podania badanego preparatu, a wybrane organy (wątroba, nerki, mózg, ew. inne) zostaną poddane dalszej analizie. W innej serii doświadczeń badane substancje dozowane będą przez kapsułkę (pompę Alzac) umieszczoną pod skórą myszy. Zwierzęta umieszczone zostaną w klatkach metabolicznych, mocz i kał zbierane będą do analizy radioizotopowo znakowanych metabolitów. Zwierzęta będą uśmiercone po 5 dniach i ich organy zostaną pobrane i analizowane pod kątem zawartości radioizotopowo znakowanych metabolitów. 8.3. Izolacja i analiza strukturalna znakowanych trytem metabolitów powstających z amino-[3H]Prenoli lub epoksy-[3H]Prenoli Przeprowadzona będzie ekstrakcja produktów metabolizmu amino-[3H]Prenoli i epoksy-[3H]Prenoli. Zebrane tkanki, podobnie mocz i kał, będą ekstrahowane mieszaniną chloroformu i metanol w odpowiednich proporcjach. Uzyskane ekstrakty będą analizowane pod kątem obecności znakowanych trytem związków (produktów mniej i bardziej polarnych). Do analizy wstępnej wykorzystane będą metody chromatograficzne (TLC, CC, HPLC) w połączeniu z pomiarem radioaktywności. Wstępnie scharakteryzowane metabolity przekazane zostaną do dalszych badań strukturalnych do IBB i IChO w Warszawie. 8.4. Podawanie nieznakowanych amino-Prenoli lub epoksy-Prenoli i ich pochodnych do komórek i zwierzętom hodowlanym, badania toksyczności, izolacja produktów metabolizmu i analiza strukturalna Wybrany amino-Prenol lub epoksy-Prenol lub jego pochodna hydrolizowana podawany będzie w zróżnicowanych dawkach (w zakresie niskich i wysokich stężeń) do komórek HepG2 przez dłuższy czas, aby ocenić przeżywalność komórek. Równolegle, zwierzętom hodowlanym przebywającym w klatkach metabolicznych podawane będą badane substancje przez okres 2 tygodni. Prowadzone będą obserwacje fizjologiczne, zbierany będzie mocz i kał. Zebrane próbki (organy zwierzęce, mocz i kał)ekstrahowane będą mieszanina chloroform-metanol. Wyizolowane metabolity analizowane będą jak opisano wyżej. 8.5 Badnia wpływu amino-prenoli, epoksy-prenoli i ich pochodnych na indukcję ekspresji genów - analiza transkryptomiczna Badany będzie wpływ badanych związków na profil mRNA wybranych genów. Z części materiału biologicznego uzyskanego z powyższych doświadczeń wyizolowane będzie totalne RNA. Równoległe próbki przygotowane będą z komórek i tkanek kontrolnych, tzn. nie poddanych działaniu testowanych związków. Próbki analizowane będą metodą Real-time PCR. Równolegle, analiza zmian ekspresji genów w badanych próbkach zostanie wykonana przy użyciu mikromacierzy (Affymetrix) w IBB PAN. Efekty merytoryczne Zadania 8 uzyskane w przez grupę badawczą: 1 rok realizacji projektu izolacja produktów metabolizmu epoksy-[3H]Prenoli powstających w komórkach HepG2 1,5 roku realizacji projektu analiza strukturalna produktów metabolizmu epoksy-[3H]Prenoli 2,5 roku realizacji projektu izolacja produktów metabolizmu amino-[3H]Prenoli powstających w komórkach HepG2 3 lata realizacji projektu analiza strukturalna produktów metabolizmu amino--[3H]Prenoli wstępna identyfikacja genów indukowanych lub hamowanych przez epoksy-Prenole i amino-Prenole 3,5 roku realizacji projektu analiza strukturalna produktów metabolizmu epoksy-prenoli 4 lata realizacji projektu przygotowanie zgłoszeń patentowych